现代分子生物学和免疫学的进展加深了我们对许多疾病的了解，并且导致了免疫新策略的产生，用转基因植物来表达疫苗抗原是其中的一项新尝试。植物表达的抗原已经被证明能够延缓或防止某些疾病的发生，这一发现对人类医学研究影响巨大，目前已经有人成功应用该技术在香蕉上表达了人乙肝病毒表面抗原以及艾滋病病毒的免疫原基因，试想将来人们只要吃了一条香蕉或蔬菜就可以防止某些疾病的发生，这对于广大发展中国家的人民来说，无疑是一个福音。在家禽可食用性疫苗的研究方面，美国奥本大学家禽系Giambrone所在的研究小组已经成功将法氏囊病毒的VPZ基因和病毒性关节炎病毒的S1基因在植物上得到了表达，目前正在进行免疫原性测试，在不远的将来，我们可能用该植物做成饲料喂鸡，鸡在采食之后得到免疫力，因而无需其它免疫接种，这一新概念将引起疫苗研究的一场革命。以下将撰文把这一新技术介绍给广大的禽业工作者。 1可食用性疫苗的早期研究 首次发现植物能表达免疫原基因是在年，CuniSS和Cardineau成功用烟草表达了链球菌表面蛋白抗原A（SPA），当他们把转基因烟草饲喂小鼠后，发现它能诱导粘膜免疫。此后，相继有人报导了用 烟草和葛营成功表达了乙肝表面抗原和狂犬病病毒免疫原基因，以及用苜蓿表达了人巨细胞瘤病毒和口蹄疫病毒的抗原，动物试验证实了这些表达产物的免疫原性。和其它疫苗生产表达系统比较，转基因植物系统有哪些优点呢？ 众所周知，病原基因可以在不同的系统上进行表达，理想的表达系统应该是高效、安全以及经济。用哺乳动物细胞表达抗原能够保持表达产物的天然性，也就是与原有宿主更相近，但是培养这些细胞很昂贵，因而仅能在小范围内应用。微生物表达系统，例如细菌，虽然利于大规模生产，但是它的表达产物与原有的宿主在免疫原性上可能有很大差异，原因是细菌没有翻译后的修饰功能，因而表达产物作用不大。用转基因植物生产疫苗有以下优点：①植物表达系统比用发酵系统或其它生物反应器更经济，它不需要昂贵的设备，②植物易于大规模种植，收获和加工③用植物生产的免疫原性蛋白木需要纯化，④外源基因在植物中能通过细胞间隙直接到达靶器官，因而它们更稳定，有些甚至能在细胞器中直接表达，⑤它的表达水平能达到工业化的生产水平，⑤它不会与其它动物病原产生交叉污染。 2转基因植物的生产过程 首先必须分离病原的免疫原基因，然后将该基因转移至能在植物上高效表达的载体中，下一步要将该载体转移至农杆菌，农杆菌是一种能够将病原基因转移至植物基因组的细菌，把基因转移至植物中的方法很多，这些方法在植物生化工业中已经相当成熟，农杆菌转染法仅是方法之一。一旦得到第一代转基因植物种子，就可以利用其抗生素抗性或其它抗性对其进行筛选，至少筛选3代后，结合蛋白测定，选择表达量最高的植株进行大量生长，对收获的植株进行加工处理测定后即可应用。 3可食用性疫苗的免疫基理 植物是天然的生物反应器，可食用性疫苗研制的理论基础是疫苗病原的抗原蛋白能在植物组织中合成，在给人或动物食用后而产生免疫力。可食用性疫苗面临的一个严峻的问题是必须能耐受消化道系统恶劣的pH环境以及降解。在这一方面植物细胞坚韧的细胞壁可以提供一些保护。可食用性疫苗的作用主要依赖于诱导粘膜免疫。粘膜免疫系统是动物抵抗病原感染的第一道防御系统，在消化道、呼吸道以及泌尿生殖道表面都有粘膜，粘膜免疫应答开始于M细胞（多层皱指细胞）对抗原的识别，这些细胞位于淋巴组织的粘膜内，例如小肠的佩氏结。M细胞能把抗原送至抗原提呈细胞富集的深层组织并加工抗原，产生的抗原表位被送至抗原提呈细胞的表面，在辅助性T细胞的作用下激活B细胞，激活的B细胞迁移至肠系膜淋巴结成熟后进入血液并转移至粘膜表面分泌免疫球蛋白A，一旦通过粘膜上皮层进入肠腔，IgA就会与膜分泌性成分结合形成分泌性IgA（slgA）进入肠腔，SigA能与特异性的抗原表位结合并中和入侵的病原。理论上消化的植物表达疫苗能导致特异性的保护性粘膜分泌性IgA和血清IgG的产生，从而抵抗疾病的发生。 4可食用性疫苗的研究进展 近年来的研究主要集中于如何满足人和动物的临床应用，对于其使用剂量、使用方法、免疫应答类型、免疫应答的强度以及持续时间都进行了详细的研究。关于动物方面的研究，有四种病毒有了相关的报道，即猪传染性胃肠炎病毒、兔瘟病毒、口蹄疫病毒和鸡传染性法氏囊病毒，动物试验结果都取得了较好的免疫应答。进一步的研究试图用一种合成基因在特定的植物组织中表达免疫原基因并提高表达效率。 使用可食用性植物来制备疫苗提供了一种比发酵系统更经济实惠的方法，编码细菌和病毒的抗原能在可食用组织中得到忠实表达而形成免疫球蛋白，在人和动物的研究中表明，食用含有疫苗蛋白的植物能引起血清和粘膜分泌物中特异性抗体的产生，但突出的问题是表达量低下，近来用植物器官转染法能够增加表达，再加上蛋白质工程的研究进展，有望解决这一问题。到目前为止已经用转基因植物生产了一系列抗体和疫苗，具体见表1。 表1用转基因植物表达的蛋白 病原表达的蛋白表达植物表达水平原（占总可溶性蛋白的比例） 产肠毒素型耐热型毒素B亚单位烟草＜0.01% 大肠杆菌 霍乱弧菌霍乱毒素B亚单位土豆＜0．3％ 乙肝病毒表面抗原蛋白莴苣＜0．01% 狂犬病病毒糖蛋白番茄1．00％ 免瘟病毒VP60土豆0．3％ 口啼疫病毒VP1苜蓿未定 传染性胃肠炎病毒糖蛋白烟草0．20％ 传染性法氏囊病毒VP2黎橄榄未定 目前用不同植物系统来表达亚单位疫苗抗原的报道很多，这是动物学和植物学交叉发展的结果。研究表明转基因植物表达的蛋白具有免疫原性，有些甚至能抵抗强毒攻击，但是要真正应用到临床还有许多工作要做，提高表达水平是当务之急，另外对于其使用剂型、保护植物蛋白免受降解的佐剂、产品组成、环境污染以及有关粘膜免疫的基理和相关转基因产品的使用法规都需要进行研究。至于是否会引起免疫耐受则要因不同个体分别进行研究，因为不同的蛋白质对酸和蛋白酶的抵抗力各异。用转基因植物生产禽用疫苗的概念一经产生以来，因其使用简单，费用低廉，引起了很多研究者的注意，很多大公司为此投入了巨大的人力和物力对其进行研究开发，希望在不久的将来，在理论和应用上有一个新的突破，为保障养禽业生产作出贡献。
转基因植物疫苗研究进展
随着植物高效基因载体系统和遗传转化技术的发展，利用转基因植物生产人或动物基因工程疫苗用于疾病的预防及治疗已成为植物基因工程的一个新兴研究领域。与目前的细菌、酵母及哺乳动物细胞等传统疫苗生产系统相比，用转基因植物生产基因工程疫苗具有其独特的优势：①植物细胞的全能性；②完整的真核细胞表达系统，使表达产物具有较好的免疫原性及生物活性；③口服植物疫苗能诱导粘膜免疫反应；④植物细胞的细胞壁起到生物胶囊的作用；⑤生产简便、成本低廉，不需要冷藏和低温运输；⑥安全性好，无外源性病原污染等。目前，转基因植物疫苗的研究主要有两个方向，一种是利用植物生产大量的蛋白质抗原，经分离和提纯再制备成疫苗；另一种是不需要分离和提纯，将植物或其某部分作为可以直接口服的疫苗。l转基因植物生产疫苗的原理与方法转基因植物疫苗(transgenieplantvaccine)或植物疫苗(plant-basedvaccine)是借助植物遗传转化载体将抗原基因导入植物，使其在植物中表达，生产出能使机体获得特异抗病能力的疫苗。植物遗传转化的受体系统、载体系统和遗传转化方法是转基因植物基因工程疫苗生产技术的关键。目前在植物生产基因工程疫苗方法上的研究主要有3种，一是以植物病毒为载体的瞬时表达，此途径不属于转基因植物的范畴；二是农杆菌介导的核转化，将携带重组质粒的农杆菌感染植物细胞后，导人的外源基因通过同源重组整合到细胞染色体上，含整合外源基因染色体的植物细胞在一定条件下长成新的植株，此植株在生长过程中表达外源基因并将这种性状传给子代；三是用基因枪法进行叶绿体转化，为了实现外源DNA的定点整合，构建叶绿体表达载体时，一般在外源基因表达盒的两侧连接同源重组片段或定位片段(targetingfrag．ment)，当载体被导人叶绿体后可将外源基因整合到叶绿体基因组的特定位点。2不同植物中表达疫苗抗原及免疫原性评价近年来，已有众多研究表明转基因植物表达的疫苗抗原能诱导人或动物体内产生特异性中和抗体及激发粘膜免疫应答。由于动物疫苗的试验能比人用疫苗更快地付诸于临床应用，更多的学者致力于研发预防动物传染病的植物疫苗。因为不同的受体植物对抗原蛋白翻译后修饰的差异以及植物本身不同蛋白的影响，研究报道的转基因植物疫苗免疫原性及对动物的免疫保护水平差异较大。2．1模式植物中表达疫苗抗原的研究植物模式研究工具烟草、拟南芥(Arabidopsisthaliana)基因表达系统已充分特征化，便于确定蛋白质特征。Khandelwal等以烟草作为表达牛瘟病毒(finder-pestvirus，RPV)血凝素(hemagglutinin，H)蛋白的模型，用烟草花叶提取物腹腔接种小鼠，1—9周其血清中和抗体滴度达1：～l：，且H蛋白特异性的高效价抗体能完全中和RPV。以烟草作为受体植物的还有Bae等研究小组的报道，他们将表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)刺突蛋白(spikeprotein)中和表位(COE)的烟草花叶提取物饲喂小鼠，在血清和粪样中分别检测到高水平的IgG和IgA；空斑减数试验(plaquereductionneutralizationassay)表明抗COE血清对靶细胞中病毒生长抑制程度比对照组增加了49．7％，说明饲喂此转基因烟草能诱导全身性及粘膜免疫反应且能有效抑制病毒对宿主细胞的感染。Gomez等培育了转猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)s糖蛋白基因拟南芥，并用ELISA检测叶提取物免疫后的小鼠抗血清，发现产生的抗体能与TGEV发生特异性反应。2．2可食性植物中表达疫苗抗原的研究已有越来越多种类的受体植物被考虑用作基因工程亚单位疫苗生产系统的研究。Zhou等报道将禽传染性支气管炎病毒(IBV)sl糖蛋白基因转人马铃薯(Solanumtuberosum)块茎表达，产物提取液肌注接种小鸡，经三免后用鸡气管环培养(TOC)中和试验检测IBV抗体，抗体滴度可达1：。在番茄叶片及果实中表达的霍乱毒素B亚单位(CTB)用Gm1-ELISA检测发现具有天然的Gm1-神经节苷脂结合活性。Kapusta等研究了HBsAg在转基因羽扇豆(LupinusluteusL．)和莴苣(LactucasativaL．)中的表达，并在服用莴苣的志愿者血清中检测到特异性血清IgG。用转基因苜蓿表达口蹄疫病毒(FMDV)抗原表位VPl35—基因，对免疫小鼠进行攻毒试验，具有较好的免疫保护作用。此外，Bouche等将一特殊重组多肽转入胡萝卜表达，用于抗麻疹病毒的感染，中和试验表明，从胡萝卜提取物免疫小鼠体内分离的血清能特异性抑制包括实验室毒株在内的15个不同地理分离株在麻疹病毒细胞受体CDl50转染的Vero细胞中复制繁殖。2．3转基因农作物疫苗的免疫原性研究豆类(大豆、花生)或谷类植物(玉米、水稻、小麦)广泛种植且产量高，种子中蛋白丰富且易于贮存，重组蛋白水平较高，作为动物疫苗极适合饲喂免疫。Lamphear等在玉米种子中表达出传染性胃肠炎病毒刺突蛋白(TGEV-S)和E．coli不耐热肠毒素B亚单位(Lt-B)作为预防肠毒性大肠杆菌(ETEC)及TGEV的疫苗，研究发现抗原蛋白在谷物加工过程中能保持自身活性且均能诱导血清和粘膜免疫应答，4qC下种子的贮藏期可达10个月以上。Khan—delwal等报道用转RPVH蛋白基因花生(Am—chishypogeaL．)叶片饲喂牛可诱导产生H一特异性抗体，且能诱导其外周血单核细胞(PBMC)体外增殖反应。最近有报道将小反刍兽瘟病毒(Pestedespetitsruminantsvirus，PPRV)的抗原蛋白血凝素一神经氨酸苷酶(HN)基因转入鸽豆(Cajanuscaja~(L．)Millsp．)内表达，并测得植物源HN蛋白具有较好的神经氨酸苷酶活性。3免疫原基因的高效表达策略转基因植物疫苗最主要的技术问题是要取得重组抗原在植物中的高水平表达，即抗原的有效表达。早期的研究报道中，抗原在植物中表达量大多数占总可溶蛋白(totalsolutionprotein，TSP)的O．％～0．3％。为了提高抗原的表达量使植物疫苗达到有效的免疫作用，众多学者开展了如何使免疫原基因能高效表达的研究工作，并取得了一定的进展。3．1优化重组基因结构免疫原在植物中的有效表达，在一定程度上依赖于选择合适的保护性抗原编码序列以及构建适宜于植物转化的表达盒。已有许多方法来优化重组基因的结构，使其能更适合在某种特定的植物中表达(表1)。3．2植物膜泡运输机制靶向表达抗原蛋白真核细胞内许多蛋白质需靠膜泡从一种细胞器运输到另一种细胞器，它的基本过程包括：膜泡在供膜(donormembrane)处芽生(budding)形成，将被运输蛋白包在其中，定向地运输到受膜(acceptormem—brane)，通过Rab蛋白的调控与受膜相互融合将被运输蛋白释放，从而完成膜泡运输过程。若将表达的不同抗原蛋白通过各种分选信号(sortingsignals)经植物细胞内膜泡定向运输到内质网(ER)、液泡(vacuoles)或分泌到胞外房室(extracel—lular
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