前沿丨发现新型猪圆环病毒PCV3能够

美国加利福尼亚大学旧金山校区一实验室近日发表文章称对3头有不明原因心脏和多器官炎症的病猪进行病原检测时，排除了PCV2和其它已知猪病原的感染的可能，进而通过组织学的方法来鉴定猪体不同组织的微观病灶。研究中使用元基因组学的方法来检测组织匀浆中的病毒序列；使用原位杂交的方法来检测心脏组织中病毒RNA的表达情况。

结果显示，在这3头病猪中我们都发现了新型圆环病毒—PCV3的存在。该新发病毒与一株从蝙蝠粪便中检测的圆环病毒基因上最相近，但两者的复制酶和衣壳蛋白也分别只有55%和35%的一致性，而与PCV1、PCV2的亲缘关系更远。普通的微观病灶包括非化脓性心肌炎和（或）心脏小动脉炎症。在病变的心肌细胞中检测到了PCV3的mRNA的存在。进一步测序结果显示，这3头病猪的组织中都检测到了猪星状病毒4型，此外，在个别猪体中也检测到了轮状病毒A，猪巨细胞病毒和猪血球凝集脑脊髓炎。

因此，这个新圆环病毒的致病性、分子流行病学、单独感染和混合感染会造成的影响等问题都需要进一步调查。

圆环病毒是迄今为止人们发现的最小的动物病毒，基因组为单股环状DNA分子，大小约2kb，猪、鸟、狗和狐狸都易感。感染猪的圆环病毒现在已经报道的有2种，PCV1和PCV2；然而报道只有PCV2能够引起繁殖障碍、呼吸系统、消化系统和心血管淋巴系统的紊乱，给养猪业造成严重的经济损失。本研究中报道了3头感染PCV3，引起心肌病变和多系统炎症的病例。

在密苏里的一个商业性猪场中大约头猪中，有2%的猪在断奶后一周出现了厌食、体重下降、关节肿胀的症状。病理解剖中猪体出现了不能解释的心肌损伤，进行进一步的检查。组织（气管、食管、关节滑液、心脏、肺脏、胸腺、甲状腺和淋巴结）用10%的中性福尔马林固定后用HE染色后在光镜下进行检查。在滑膜腔中出现了中等病变程度的纤维素性关节炎，并且伴有坏死性动脉炎。在食管中出现了坏死性动脉炎，淋巴细胞组织细胞浸润间质性肺炎和中等程度的细胞浸润型的心肌炎和动脉炎。实时荧光定量在关节液中检测出了辅助嗜血杆菌。但用PCR的方法并没有检测出PCV2,IAV,PRRSV,CSFV,瘟病毒，FMDV,PPV1和PPV2，西尼罗河病毒，猪脑心肌炎病毒，猪滑液支原体，猪肺炎支原体，猪红斑丹毒丝菌。用免疫组化的方法排除了弓形虫的感染。也未从肺脏，心脏和关节中分离出需氧菌。

研究人员用病毒宏基因组深度测序的方法，检测出了一种新的圆环病毒PCV3-US/MO，全长bp，GC含量达到50%，拥有两个开放阅读框，分别编码复制酶和衣壳蛋白。PCV3-US/MO的复制酶有个氨基酸，和PorkNW2/USA/与CircoviridaeSFBeef毒株的同源性高达95%,和蝙蝠的圆环病毒的复制酶的同源性为55%，和PCV2的复制酶同源性为48%。PCV3-US/MO的衣壳蛋白（氨基酸）和圆环病毒PorkNW2/USA/有最高的同源性，44%，但与PCV1和PCV2只有24%和26%的同源性。基于复制酶和衣壳蛋白的进化树分析如图2b所示。第三个主要的开放阅读框编码个氨基酸，和SFBeef上相似位置的个氨基酸的同源性有93%。并且和其他圆环病毒基因组类似的是，它的茎环结构包含一个保守的单元[TAGTATTAC]。根据国际病毒学分类委员会的标准，圆环病毒的成员必须在基因序列上有75%以上的同源性，其衣壳蛋白的同源性在70%以上。序列比对发现，PCV3-US/MO的基因序列和氨基酸序列同已经报道过的其他圆环病毒的同源性都少于50%，因此把它认为是一种新的圆环病毒，也是猪体上发现的第三种圆环病毒。

为了进一步研究PCV3在感染猪的心脏和肺脏的分布，我们用原位杂交的方法检测PCV3的mRNA。在心肌细胞，发炎小动脉的血管中膜以及心肌细胞中的炎性细胞（可能是巨噬细胞）均检测到散在的多病灶的PCV3的mRNA,而在肺脏中没有检测到PCV3的mRNA。

年5月，来自明尼苏达的病死猪被送到UMN-VDL进行剖检和诊断。这头猪大约9-10周龄，曾经有呼吸道疾病和直肠脱垂。用PCR的方法在组织中没有检测到猪肺炎支原体，猪滑液支原体，猪红斑丹毒丝菌，流感病毒，PCV2,EMCV,PPV1和PPV2。在脑脊液和关节液中没有分离到细菌。

经过深度测序，其病毒基因组中含有和PCV3-US/MO基因组相似性达到98.95%的圆环病毒，和基因组相似性大于99%的猪脊髓炎病毒(KU.1)以及基因组相似性在92-99%的猪星状病毒4(JF.1)。所以其组织中含有PCV3，以及其他两种RNA病毒。

19日龄的病死猪剖检后，通过光镜检查发现，该猪患有严重的弥散性淋巴细胞心肌炎，中等程度的间质性肺炎和急性支气管炎。未分离到需氧菌和沙门氏菌，也未检测到PRRSV，PCV2，EMCV,流感病毒，猪肺炎支原体和猪滑膜支原体。

经过深度测序，其病毒基因组中含有和PCV3-US/MO和PCV3-US/MN基因组相似性达到99%的圆环病毒，和氨基酸序列相似性达到72-%的PAstV4以及氨基酸序列相似性在97-98%的马肝炎病毒(JQ.1)。所以其组织中含有PCV3，PAstV4和马肝炎病毒。

PCV2是造成世界范围内猪系统性疾病的一种病原，并且常被发现和其他病毒和细菌一起混合感染。PCV2感染能引起胎儿的感染和死亡，导致温和或者严重的淋巴细胞心肌炎。PCV2的感染也被认为是一种最常见的导致猪产生心肌炎的病原之一。有意思的是，PCV2导致的心肌炎中，其病毒核酸是在小动脉的中膜和炎性细胞中能检测到，这和PCV3的感染分布情况是类似的。

所有PCV3感染的猪是在2-3至9-10周龄。这表明这个病毒主要侵害出生后日龄较小的猪，同时也得考虑垂直传播。有意思的是，在一些与PCV2有关的疾病，例如猪多系统衰竭综合征主要发生在5-12周龄的猪。而这被认为是青年猪通过母乳获得的母源抗体下降所导致的。

把该报告中的动物发病归因于一种潜在的新病原，同时却没有满足科赫法则，是会受到质疑的。一般的做法是，首先消除已知的能引起相同损伤的常见病原，然后研究其流行病学，临床症状，病理学和微生物学来支持其病原与疾病之间的关系。在本实验中，能造成相同动脉炎，也就是非化脓性的心肌炎的病原就是PCV2和PRRSV，并且通过特异性的检测加以排除。其他潜在的能导致非化脓性心肌炎的病原在最初的诊断中已经被排除。同时，通过宏基因组测序，我们鉴定出了一种新的病原PCV3，并且在病例1中的心肌细胞，发炎小动脉的血管中膜以及心肌细胞中的炎性细胞（可能是巨噬细胞）均检测到散在的多病灶的PCV3的mRNA。这个结果表明PCV3造成的心肌损伤和PCV3的mRNA具有联系。然而，虽然所有病例都检测出了PCV3，但是也都检测出了PAstV4。PAstV4可能扮演的病原角色是单独引起病变，也有可能是和PCV3一起引起病变。PAstV4，第一次检测到是在年的匈牙利的猪的排泄物中。其后能在所有欧洲猪的70%中检测到这种病毒，并且在一些来自于明尼苏达并有腹泻症状的猪中有较高的病毒载量。PAstV4也能从克罗地亚的健康猪中检测到，一个与之相关的星状病毒从美国的患有急性呼吸系统疾病的猪的鼻拭子中检测到。虽然PAstV4是一个普遍存在于健康和腹泻的猪中的病毒，但其能通过系统性血液感染以及可以和其他病原共感染，如PCV3等，因此可以认为其可以引起其他的临床症状。其他病原，如在案例一中的轮状病毒和猪巨细胞病毒，案例2中的猪脑脊髓炎病毒和案例三中的马肝炎病毒的作用并不清楚。猪脑脊髓炎病毒是不常见的病毒，可能和案例2中的神经损伤有关。马肝炎病毒的出现可能是由于马血清的污染。

用深度测序的方法检测一种新的圆环病毒的基因组，并通过ISH进行验证，实验表明PCV3能在心脏组织中进行复制。在牛肉和猪肉中都能检测到圆环病毒，这表明圆环病毒的嗜性可能扩展到其他的有蹄类动物。这些之前报道的有缺陷的PCV3类似的基因组表明可能存在一个辅助病毒来补充丢失的衣壳蛋白的功能。虽然案例1中导致心肌炎和动脉炎的病原并没有确认，并且其他的病原也能从心肌中检测出来，但检测出了这种新病原PCV3还是有可能在这种临床疾病中扮演一定角色。另外两个案例中都出现了心肌和多系统的炎症反应的现象也进一步支持了PCV3作为病原的角色。

进一步研究PCV3的组织嗜性能够使我们明确其可能感染的细胞类型。细胞培养系统能帮助我们扩展我们的体外研究和动物实验。虽然在美国多个地方都能检测到PCV3，但其地理分布仍然需要确定。如果澳大利亚的相似病例证明是PCV3的话，那其地理分布又可以扩展了。PCV3是长期存在还是在最近种系间杂交产生的，并没有人知道。要想知道这个问题的答案，就必须去研究历史样本。因为亲缘关系最近的圆环病毒是从中国的菊头蝠中分离的，因此PCV3的来源极有可能是蝙蝠。更深入的研究来更好的理解PCV3在猪群中的分布以及在猪病中扮演的角色是一定会继续下去的。

从三头患有多系统炎症和心肌疾病的猪中分离到一种命名为PCV3的新的圆环病毒。对PCV3的全基因组进行测序，并通过序列比对发现其实圆环病毒属的一个新的种。原位杂交实验在心脏损伤处检测到PCV3的病毒核酸再次证明了病毒的感染，也表明其对猪只潜在的致病性。